Szybkie wykrywanie paciorkowców grupy B u kobiet w ciąży przy porodzie cd

Kontrola wewnętrzna dodana do każdej reakcji PCR pozwoliła nam ocenić skuteczność reakcji amplifikacji i upewnić się, że nie było hamowania PCR. Ponadto jako kontrolę pozytywną zastosowano oczyszczone genomowe DNA streptokokowe grupy B. Wielokrotne próby ślepe zostały również uwzględnione jako kontrole negatywne, aby zweryfikować, czy nie było wzajemnego zanieczyszczenia między próbkami. W celu amplifikacji mieszaniny reakcyjne poddano denaturacji w 94 ° C przez 3 minuty, a następnie 40 cyklach sekundy w 95 ° C i 30 sekundach w 55 ° C w etapie hybrydyzacji i wydłużania, z końcowym okresem wydłużenia w 72 ° C. ° C przez 2 minuty (model termocyklera PTC-200, MJ Research, Watertown, MA). Następnie 10 .l zamplifikowanej mieszaniny reakcyjnej analizowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Cały proces wymagał minimum 100 minut. Nowe oznaczenie PCR
Badanie PCR w czasie rzeczywistym specyficzne dla paciorkowców grupy B zostało opracowane za pomocą nowego, szybkiego aparatu do amplifikacji DNA (LC 32 LightCycler, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho), który łączy cykle cieplne powietrza i system wykrywania oparty na fluorescencji. W tym celu użyto dwóch par sąsiednich sond hybrydyzacyjnych znakowanych fluorescencyjną cząsteczką reporterową, które hybrydyzują z amplikonem specyficznym dla paciorkowców grupy B lub z amplikonem kontroli wewnętrznej.9 Te sąsiednie sondy, które są rozdzielone jednym nukleotydem, generują zwiększone poziomy. fluorescencja podczas hybrydyzacji z ich sekwencjami docelowymi w wyniku przeniesienia energii rezonansu fluorescencyjnego.
Do amplifikacji .l surowego lizatu dodano do 9 .l mieszaniny reakcyjnej do amplifikacji. Mieszaniny reakcyjne poddano etapowi nasycenia wstępnego w 94 ° C przez 3 minuty, a następnie 45 cyklach sekundy w 94 ° C, 15 sekund w 56 ° C i 3 sekundach w 72 ° C, z szybkością zmiany w temperatura 20 ° C na sekundę. Fluorescencję mierzono w każdym cyklu w każdej kapilarze za pomocą wbudowanego fluorometru. Zastosowano kontrole wewnętrzne i pozytywne.
Podjęto ścisłe środki ostrożności w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu krzyżowemu zamplifikowanego DNA.11 Procedury wykonane przed manipulacjami PCR i te wykonywane później przeprowadzono w oddzielnych pomieszczeniach. Zastosowanie LightCycler eliminuje potrzebę analizy po amplifikacji, minimalizując w ten sposób ryzyko zakażenia krzyżowego.
Figura 1. Figura 1. Wyniki konwencjonalnego testu PCR (panel A) i nowego testu PCR (panel B) do wykrywania paciorkowców grupy B w połączonych próbkach pochwowych i analnych od kobiet w ciąży. W konwencjonalnym teście PCR produkt amplifikacji specyficznej dla paciorkowców grupy B wynosi 153 bp, podczas gdy produkt o 252 bp reprezentuje amplikon kontroli wewnętrznej (panel A). W nowym teście PCR zakres amplifikacji specyficznej dla paciorkowców grupy B mierzy się pod względem wzrostu fluorescencji podczas procesu amplifikacji (panel B). W każdym panelu próbka została uzyskana od kobiety silnie skolonizowanej; próbka 2 została uzyskana od lekko skolonizowanej kobiety; próbkę 3 uzyskano od kobiety bez kolonizacji; próbka 4 była kontrolą pozytywną, do której dodano 10 fg oczyszczonego genomowego DNA streptokokowego grupy B; a próbka B była kontrolą negatywną, do której nie dodano docelowego DNA
[przypisy: floxal krople do oczu zamiennik, badania ginekologiczne rodzaje, zakrzep zatoki jamistej ]
[więcej w: ostra przednerkowa niewydolność nerek, zatrzymanie pracy nerek, hiperkineza ]